Быстрому развитию генной терапии, несомненно, способствовали результаты, полученные в ходе выполнения международного проекта «Геном человека», который был начат в 1988 г. Это один из самых трудоемких и дорогостоящих проектов в истории науки. Если в 1990 г. на него было потрачено около 60 миллионов долларов в целом, то в 1998 г. одно только правительство США израсходовало 253 миллиона долларов, а частные компании – и того больше. В проекте задействованы несколько тысяч ученых из более чем 20 стран. С 1989 года в нем участвует и Россия, где по проекту работает около 100 групп.
Основная цель первого этапа проекта – выяснить последовательность нуклеотидов во всех молекулах ДНК человека и установить локализацию, т.е. полностью картировать все гены человека. Ожидается, что на следующем этапе исследователи определят все функции генов и разработают возможности использования полученных данных, которые будут использованы в генно-терапевтических работах для лечения и предупреждения наследственных болезней.
Генную терапию на современном этапе можно определить как лечение наследственных, мультифакториальных и ненаследственных (инфекционных) заболеваний путем введения генов в клетки пациентов с целью направленного изменения генных дефектов или придания клеткам новых функций. Первые клинические испытания методов генной терапии были предприняты 22 мая 1989 года с целью генетического маркирования опухоль-инфильтрующих лимфоцитов в случае прогрессирующей меланомы. Первым моногенным наследственным заболеванием, в отношении которого были применены методы генной терапии, оказался наследственный иммуннодефицит, обусловленный мутацией в гене аденозиндезаминазы (ADA). 14 сентября 1990 года в Бетесде (США) четырехлетней девочке, страдающей этим достаточно редким заболеванием (1 : 100 000), были пересажены ее собственные лимфоциты, предварительно трансформированные вне организма (ex vivo) геном ADA (ген ADA + ген neo + ретровирусный вектор).
Лечебный эффект наблюдался в течение нескольких месяцев, после чего процедура была повторена с интервалом 3-5 месяцев (Culver R.W., 1994). За три года терапии в общей сложности проведены 23 внутривенные трансфузии ADA-трансформированных Т-лимфоцитов без видимых неблагоприятных эффектов. В результате лечения состояние пациентки настолько улучшилось, что она смогла вести нормальный образ жизни и не бояться случайных инфекций. Столь же успешным оказалось и лечение второй пациентки с этим заболеванием. В настоящее время клинические испытания генной терапии этого заболевания проводятся в Италии, Франции, Великобритании и Японии.
В 1997 году число допущенных к клиническим испытаниям протоколов уже составляло 175, более 2000 пациентов приняли участие в их реализации. в 1999 году - около 400 клинических исследований, в которых приняли участие немногим более 3 тыс. человек. Большинство таких проектов (около 80%) касаются лечения онкологических заболеваний, а также ВИЧ-инфекции (СПИДа). ( БАРАНОВ В.С. , 1999).
Решающим условием успешной генотерапии является обеспечение эффективной доставки, то есть трансфекции (в широком смысле) или трансдукции (при использовании вирусных векторов) чужеродного гена в клетки-мишени, обеспечение длительного функционирования его в этих клетках и создание условий для полноценной работы гена (его экспрессии). Трансфекция может проводиться с использованием чистой ( голой - naked) ДНК, легированной (встроенной) в соответствующую плазмиду, или комплексированной ДНК (плазмидная ДНК, соединенная с солями, белками (трансферрин), органическими полимерами (DEAE-декстран, полилизин, липосомами или частицами золота), или ДНК в составе вирусных частиц, предварительно лишенных способности к репликации.
При генной терапии чаще всего используют метод внесения терапевтического гена. Разрабатывают также методы коррекции дефектных генов (при мутациях, изменяющих небольшой участок ДНК), замены дефектного гена нормальным, методы усиления экспрессии нормального гена, восстановления экспрессии блокированного гена или методы блокады экспрессии болезнетворного гена.
Для введения терапевтического гена в клетки пациента используют специальные вектора. При этом одной из самых сложных проблем является разработка подходов, обеспечивающих специфическую, эффективную и безопасную доставку генетического материала в соответствующие клетки-мишени пациента. Проблема доставки гена значительно усложняется в тех случаях, когда необходимо перенести большой ген (вектора имеют ограниченную емкость), особенно в клеточное ядро. Правильное внесение гена обеспечивает его функционирование в течение всей жизни человека и полное излечение пациента от соответствующего заболевания.
В качестве векторов могут быть использованы ослабленные и модифицированные вирусы (ретровирусы, аденовирусы, адено-ассоциированные вирусы, вирус герпеса и др.) или синтезированные векторы, способных переносить гены реципиенту. Для клинического применения векторы должны обладать определенными качествами. Однако универсального вектора не существует. Любой вектор имеет свои преимущества и недостатки. Одни векторы легко проникают в делящиеся клетки, но не способны инфицировать клетки, находящиеся в состоянии покоя (ретровирусы); другие — могут вызывать иммунный ответ на вирусные белки, тем самым приводя к быстрой элиминации (гибели) внесенного генетического материала из организма (аденовирусы); третьи — способны проникать в неделящиеся клетки, но могут представлять потенциальную опасность для человека (лентивирусы, например, ВИЧ); четвертые — непатогенны, могут инфицировать неделящиеся клетки и обеспечивать достаточно длительную экспрессию внесенных генов, но они не могут переносить большие участки ДНК и их трудно получить в большом количестве (адено-ассоциированные вирусы); пятые — неиммуногенны, могут доставлять большое количество генетического материала в организм человека, но значительно меньшее — внутрь клеточного ядра, к тому же относительно быстро разрушаются в организме или перенесенный ген экспрессируется кратковременно (липосомы).
Выбор вектора и метода его доставки определяется конкретной целью генной терапии, поскольку от характера заболевания зависит, в клетки каких тканей необходимо ввести гены, как долго и в каком количестве они должны экспрессироваться и др. Использование векторов в клинических испытаниях демонстрируют таблицы:
В качестве клеток-мишеней использовали лимфоциты, клетки костного мозга, солидных опухолей, печени, легких, сердца, скелетных мышц и др. В последующих клинических исследованиях стали применять различные подходы in vivo, используя для переноса генетического материала в организм реципиента все возможные пути введения (всего в клинических исследованиях использовано 18 разных путей введения).
Прямая инъекция генетического материала – самый простой метод доставки трансгена в клетки in vivo, при котором ДНК вводится непосредственно в ткань путем инъекции. Область использования данного метода ограничена такими тканями, как кожа, тимус и поперечно-полосатые мышцы, некоторыми так называемыми солидными опухолями. Достаточно продолжительная (до года) экспрессия трансгена наблюдается преимущественно в мышечной ткани. Эффективность такой трансфекции обычно низкая (менее 1%), но вполне достаточная, например, для генетической иммунизации.
Баллистическая трансфекция основана на обстреле органов и тканей микрочастицами тяяжелых металлов (золото, вольфрам), покрытых плазмидной ДНК. Микрочастицы проходят через клеточные слои и переносят генетическую конструкцию непосредственно в ядра клеток. Глубина проникновения, как правило, невелика – до 1мм, поэтому метод используется преимущественно для трансфекции клеток кожи и подлежащего хряща. Однако при особых условиях обстрела микрочастицы могут проникать в ткань на глубину до 4-5 мм и переносить ген в волокна поперечно-полосатых мышц.
Введение генетического материала внутрь кровеносных сосудов, питающих трансфицируемый орган применяется в первую очередь для лечения болезней печени, почек и мочевыводящих путей. Аэрозольное введение генетического материала в дыхательные пути используется при лечении заболеваний легких. (А.В.Зеленин, 2000).
Таким образом, стандартная схема генокоррекции наследственного дефекта включает серию последовательных этапов. Она начинается созданием полноценно работающей (экспрессирующейся) генетической конструкции, содержащей смысловую (кодирующую белок) и регуляторную части гена. На следующем этапе решается проблема вектора, обеспечивающего эффективную, а по возможности и адресную доставку гена в клетки-мишени. Затем проводится трансфекция (перенос полученной конструкции) в клетки-мишени, оценивается эффективность трансфекции, степень коррегируемости первичного биохимического дефекта в условиях клеточных культур (in vitro) и, что особенно важно, in vivo на животных - биологических моделях. Только после этого можно приступать к программе клинических испытаний. С точки зрения генной терапии, самыми простыми болезнями являются моногенные болезни, те, которые требуют работы с одним геном, например, гемофилия, мышечная дистрофия Дюшенна, серповидно-клеточная анемия. Имеются данные о разработке экспериментальных подходов и проведении предклинических и клинических испытаний методов генной терапии почти 30 моногенных заболеваний человека. Однако в первых клинических исследованиях не удалось достичь продолжительного терапевтического эффекта (за исключением применения генной терапии у больных с наследственным дефицитом фермента аденозиндезаминазы).
В ходе клинических исследований часто возникали определенные проблемы: векторы не всегда достигали нужных клеток, перенос генов был неэффективен или их экспрессия недостаточно продолжительна для достижения терапевтического эффекта, часто развивался клеточный или гуморальный иммунный ответ на вирусные или чужеродные белки, что требовало введения повторных доз генетического материала, и др. Выявленные недостатки и возникшие проблемы вызвали необходимость проведения фундаментальных, более целенаправленных клинических исследований. В результате моногенным заболеваниям посвящено лишь около 10% общего числа протоколов генной терапии.
Более сложными являются исследования в направлении ряда приобретенных заболеваний, развитие которых обусловлено комплексным взаимодействием генов и воздействием факторов окружающей среды— диабета, остеопороза, ревматоидного артрита, рака и даже СПИДа. Результаты первых клинических испытаний этих подходов оказались в высшей степени обнадеживающими, в особенности при лечении нейродегенеративных и онкологических заболеваний нервной системы. Значительная часть клинических исследований посвящена лечению больных со злокачественными новообразованиями (около 64% от числа всех исследований), с наследственными моногенными болезнями (13%) и инфекционными заболеваниями (8%), в частности СПИДом.
В настоящее время наибольшее распространение получила генная терапия опухолевых заболеваний, по-видимому, из-за огромного множества раковых заболеваний в мире. С другой стороны в отношении тяжелых, часто безнадежных раковых больных утрачивают своё значение такие соображения, как отдаленный риск генетических повреждений
Специалисты полагают, что перспективная технология генной терапии СПИДа, например, позволит значительно сократить расходы на широко используемое в настоящее время противовирусное лечение, которое далеко не всегда эффективно и нередко сопровождается серьезными осложнениями.
Разрабатываемые методы генной терапии направлены на устранение повторных инъекций лекарственных препаратов, что является существенным преимуществом для пациента, в том числе экономического характера.
Сейчас разрабатывается метод генной терапии, при которой вектор будет содержать ген, кодирующий продукцию какого-либо белка, а также молекулярную структуру, которая способна регулировать экспрессию гена в зависимости от приема внутрь специального лекарственного средства.
В кардиологии разрабатывают методы использования аденовирусных векторов для переноса генов, способных вызывать гиперплазию миоцитов в клетки миокарда пациентов, перенесших инфаркт. Однако повреждение клеток в результате прямого введения генетического материала в миокард, а также индукция клеточного иммунного ответа на антигены аденовируса пока препятствуют внедрению этих методов в клиническую практику.
Для лечения ишемической болезни сердца перспективен метод генной терапии, направленный на стимуляцию образования новых кровеносных сосудов (ангиогенез). На стадии эмбрионального развития в процессах ангиогенеза может участвовать множество факторов роста. Однако у взрослого человека ангиогенные факторы в основном продуцируются при заживлении ран, а также при некоторых патологических процессах (росте злокачественных опухолей или при диабетической ретинопатии). При разработке методов ангиогенной генной терапии изучают факторы роста, которые можно использовать для активации ангиогенеза. Для лечения больных с солидными злокачественными опухолями, наоборот, разрабатывают методы подавления ангиогенеза посредством ингибиции выработки эмбрионального фактора роста, стимулирующего ангиогенез.
Разработана систему, несущую ген, который кодирует продукцию одного из факторов системы свертывания крови. Введение такого вектора внутримышечно больным гемофилией предупреждает возникновение кровотечений. Результаты первых клинических исследований свидетельствуют, что после такого лечения пациенты с гемофилией более года не испытывают необходимости в инъекциях фактора. (Kaufman R.J. Advances toward gene therapy for hemophilia at the millennium//Hum.Gene Ther.1999.V.10.P.2091-2107). В настоящее время на проведение курсов заместительной терапии для одного больного гемофилией А или в США ежегодно затрачивают 100 тыс. долларов. Если новый метод лечения позволит пациентам обходиться без инъекций в течение 5-10 лет, то экономическая выгода от проведения генной терапии несомненна. (Зеленин А.В., 200; БАРАНОВ В.С.,1999).
Единственным и непременным ограничением, сохраняющим свою силу в современных условиях, при применении генной терапии для лечения многих заболеваний является то, что все генотерапевтические мероприятия должны быть направлены только на конкретного больного и касаться исключительно его самого. Принципиально, наследственные болезни можно было бы вылечить раз и навсегда, воздействуя на половые клетки или вводя здоровые гены в клетки зародыша, так, чтобы они передавались по наследству. Методы генной терапии позволяют лечить различные генетические патологии в период внутриутробного развития плода. Введенный ген, попадая во множество интенсивно делящихся клеток, предотвращает развитие заболевания. Однако современный уровень знаний не позволяет проводить коррекцию генных дефектов на уровне половых клеток и клеток ранних доимплантационных зародышей человека в связи с реальной опасностью засорения генофонда нежелательными искусственными генными конструкциями или внесением мутаций с непредсказуемыми последствиями для будущего человечества. Вместе с тем в научной литературе все чаще и настойчивее раздаются призывы к возобновлению дискуссии о целесообразности генокоррекции зародышевых и половых клеток человека.
Поскольку использование генной терапии служит темой многих религиозных, этических и медицинских споров, Совет Европы еще в 1996 году подписал конвенцию о защите прав и достоинства человека в связи с приложениями биологии и медицины. В одном из четырех пунктов этой конвенции, который касается интервенции в геном человека, подчеркивается, что всякое изменение генома может производиться только на соматических клетках. Кроме того, Конвенция о правах человека и биомедицине содержит запрет на селекции по половому признаку. В России для регламентации вопросов этики генной инженерии и геномики вообще в 1998 году принят закон «О государственном регулировании в области генно-инженерной деятельности».
Возможности исправления генетических дефектов, радикального избавления от любых болезней, которые открывает эта область науки, имеют колоссальное значение для медицины, а следовательно, для фармацевтических и биотехнологических компаний. В настоящий момент усилия биотехнологических компаний направлены на составление тестов для выявления поврежденных генов у людей с определенными заболеваниями или у тех, для кого велик риск развития этих заболеваний. Однако в самое ближайшее время основное внимание в коммерческой сфере сместится с диагностики в сторону создания методов генной терапии. Препараты будущего не станут разрабатываться обычным методом проб и ошибок. Знания о последовательностях и функциях генов и белков позволят создавать лекарства, действие которых будет нацелено на определенные области организма. Следовательно, у них будет гораздо меньше побочных эффектов, чем у современных медикаментов.
Многими фармацевтическими компаниями для производства лекарственных препаратов используется уже сегодня технология рекомбинантной ДНК. На фармацевтическом рынке к таким препаратам относятся, например, рекомбинантные аналоги человеческого инсулина и соматотропина (гормон роста) компаний Eli Lilly, Novo Nordisk, Hoechst, Berlin-Chemie, Pharmacia, эритропоэтин компании Janssen-Cilag. Все подобные современные высококачественные препараты, однако, имеют одно существенное неудобство для больных. Они предназначены для систематического введения пациентам путем иъекций. При генной терапии (и такие методы разрабатываются) пациенту можно ввести ген, который отвечает за дефицитный для организма белок, например инсулин, и необходимость повторных инъекций лекарства исчезает.
В заключение следует отметить, что за короткий период существования генной терапии выполнен огромный объем экспериментальных работ, а также проведены первые клинические исследования, что значительно укрепило её научную базу. Сегодня многие специалисты считают, что вопрос не в том, будут ли достигнуты значительные клинические успехи в результате проведения генной терапии, а в том, когда это произойдет. (C.Купцова. 2001).
За рубежом генная терапия и генодиагностика развиваются интенсивно и по уровню финансирования занимают третье место после исследований в области рака и СПИДа. К сожалению, из всех проектов по генной терапии, утвержденных Американским и Европейским комитетами по генной терапии, нет ни одного проекта из России или стран СНГ. Тем не менее, научные работы в этой области ведутся и в нашей стране. В России в настоящее время имеется ограниченное число лабораторий и центров, занимающихся технологиями генной терапии. Для исправления этого положения в рамках подпрограммы Национальные приоритеты в медицине и здравоохранении в 1996 году было создано новое направление Генотерапия . Работы по генной терапии проводятся в Институте акушерства и гинекологии имени Д. О. Отта РАМН, в Институте молекулярной биологии имени В. А. Энгельгардта РАН, Институте молекулярной генетики РАН, Институте биологической и медицинской химии РАМН, Научном центре медицинской генетики РАМН, в институтах Новосибирска. Хотя безусловно надо признать, что вклад отечественной науки в общее развитие этого направления биомедицины исчезающе мал.
Таким образом, генетическая революция, апофеозом которой явилась генотерапия, не только предлагает реальные пути лечения тяжелых наследственных и ненаследственных недугов, но и в своем стремительном развитии ставит перед обществом новые проблемы, решение которых настоятельно необходимо уже в ближайшем будущем.
