ЭкоДом

Практическое применение молекулярной медицины  - молекулярная диагностика наследственных заболеваний на любой стадии развития организма, в том числе и до рождения (пренатальная диагностика), и определение генов предрасположенности к некоторым распространенным болезням, и геномная дактилоскопия - точная идентификация личности на основе анализа особенностей структуры его генома .

В геноме человека насчитывается 35-50 тысяч различных генов, изменения в некоторых из них приводят к нескольким тысячам наследственных болезней. Гены практически всех наиболее частых (около 320) и сравнительно редких (около 170) наследственных болезней уже известны. Методы их обнаружения достаточно просты и универсальны и поэтому широко применяются в медицине.

Выявление генов наследственных болезней на ранних сроках беременности (с десятой недели) позволяет предотвратить рождение больного ребенка. Впервые в нашей стране внутриутробный диагноз (гемофилия - несвертываемость крови) был поставлен в 1989 году в Санкт-Петербурге в Институте акушерства и гинекологии имени Д. О. Отта. Затем здесь же впервые в России пренатальная диагностика позволила выявить также такие тяжелейшие генные патологии, как муковисцидоз, миодистрофия Дюшенна, фенилкетонурия, синдром ломкой Х-хромосомы

Сейчас у нас в стране можно определить около 40 наиболее тяжелых наследственных болезней. Молекулярная диагностика генов наследственных болезней проводится в НИИ акушерства и гинекологии в Санкт-Петербурге, в Научном центре медицинской генетики и Институте неврологии РАМН в Москве, в Институте биохимии и генетики научного центра РАН в Уфе, в Институте медицинской генетики в Томске и в Медико-генетическом центре в Новосибирске.

Методы молекулярной диагностики позволяют выявить не только гены наследственных болезней, но и гены предрасположенности к тому или иному заболеванию. Среди болезней, вызванных наличием в геноме генов предрасположенности, различают заболевания с поздним началом и мультифакториальные болезни. Заболевания с поздним началом (например, рак молочной железы, хорея Гентингтона, болезнь Альцгеймера, семейный полипозный рак толстого кишечника, ряд нейродегенеративных заболеваний) генетически могут быть обнаружены уже при рождении ребенка, однако видимые симптомы развиваются в более позднем возрасте. Мультифакториальные болезни (например, диабет, гипертония, атеросклероз, некоторые онкологические заболевания) также определяются при рождении, но проявляются только при неблагоприятных внешних факторах.

Молекулярная геномика уже применяется в Европе и Соединенных Штатах для решения разнообразных задач медицины и медицинской генетики. Например, в Великобритании созданы инфомационные центры, и каждый, позвонивший туда, может получить консультацию по любым вопросам, касающимся своей наследственности и генетической предрасположенности к различным заболеваниям. Во Франции создана и используется на практике компьютерная экспертная система Сезам (SESAM - Systeme Expert Specialisee aux Analyses Medicales) для определения склонности человека к различным заболеваниям. Она включает собственно экспертную систему оценки риска возникновения заболевания, основанную на многочисленных лабораторных (иммунологических, биохимических, серологических и генетических) тестах (более 80), программу для обучения врачей основам молекулярной медицины, медицинское консультирование по результатам лабораторных тестов и популярный справочник для населения. Программа прекрасно зарекомендовала себя во Франции, и хочется верить, что российские медики в недалеком будущем тоже смогут ее использовать.В перспективе это означает рождение генетически здорового потомства, значительное удлинение средней продолжительности жизни, здоровую старость. (В.БАРАНОВ,2001).

В настоящее время создана научная и материально-техническая база для широкого внедрения в клиническую лабораторную диагностику новой генодиагностической технологии - количественного определения ДНК/РНК инфекционных агентов - ПЦР. В ближайшие годы данная технология будет применяться в гепатологии (вирусные гепатиты В и С), в клинике ВИЧ и ВИЧ-ассоциированных инфекций (в первую очередь герпетическая и цитомегаловирусная инфекции), в дерматовенерологии, фтизиатрии, гастроэнтерологии, пульмонологии.

Широкое внедрение в область практического здравоохранения полимеразной цепной реакции (ПЦР) обусловлено простотой ее выполнения, низкой себестоимостью и надежностью. Количественное определение ДНК инфекционных агентов в ходе лечения позволяет получать информацию о правильности или безрезультатности проводимой терапии, помогает предсказывать периоды обострения заболевания и принимать адекватные меры для скорейшего излечения больного без нанесения ущерба для его здоровья, связанного с неэффективной терапией.

На сегодня наиболее перспективным представляется  метод ПЦР в реальном времени (Real-Time PCR) (Higuchi R. 1993.).

Сущность метода заключается в исследовании накопления продуктов амплификации с помощью специального прибора без последующего электрофореза. Так как кинетика накопления продуктов амплификации связана с исходным количеством матрицы, это дает возможность точно оценить её количество (Heid C.A. 1996.).

Отличительными чертами данного метода, в отличие от классической ПЦР, является возможность количественного определения ДНК/РНК инфекционных агентов в исследуемом материале, отсутствие стадии электрофореза, менее строгие требования к организации ПЦР-лаборатории и автоматическая регистрация и интерпретация полученных результатов.

Отсутствие стадии электрофореза позволяет минимизировать риск контаминации продуктами ПЦР и таким образом резко уменьшить число ложноположительных результатов. Поскольку регистрация результатов проводится непосредственно в процессе ПЦР, весь анализ можно проводить в одной-двух комнатах лаборатории и нет необходимости в отдельном помещении для детекции продуктов реакции.

Данная методика в течение последних пяти лет успешно применяется в крупнейших диагностических и научно-исследовательских центрах развитых стран мира и в ближайшее время станет так же широко распространена, как и ПЦР в ее сегодняшнем формате, благодаря экономии производственных площадей, уменьшению количества персонала и востребованности количественного определения ДНК/РНК.

Наиболее рационально и эффективно применение метода полимеразной цепной реакции для обнаружения микроорганизмов, трудно культивируемых в лабораторных условиях, внутриклеточных паразитов, персистирующих форм микроорганизмов, атипичных форм бактерий. Обнаружение микобактерий туберкулезного комплекса в клинических образцах является одним из основных диагностических подходов во фтизиатрии.

За последние годы в зарубежной печати появились работы, характеризующие ПЦР как метод, обладающий высокой чувствительностью, специфичностью и быстротой (в течение 4–5 часов) выявления микобактерий туберкулезного комплекса. Эти преимущества позволяют диагносцировать возбудителя на ранних стадиях заболевания и в различных биологических материалах [Kox L.F.F., 1994; Lassence A.,1992; Skarlatos S.I., 2001.)

Таблица 1. Сравнительная чувствительность и продолжительность исполнения различных лабораторных методов выявления микобактерий туберкулезного комплекса

Метод ПЦР основан на ферментативной амплификации выбранных специфических участков генома бактерий рода Mycobacterium tuberculosis(M. bovis, M. africanum, M. Microti), их дальнейшей детекции и идентификации. Аналитическая чувствительность метода, определяемая при последовательных разведениях суспензии бактериальных клеток, очень высока и составляет от 1пг до 5фг микобактериальной ДНК, что эквивалентно выявлению 1-10 бактериальных клеток.

Возрастающее число мультирезистентных штаммов Mycobacterium tuberculosis представляет собой серьезную проблему для современного здравоохранения. Лечение пациентов, инфицированных мультирезистентными штаммами, требует применения более токсичных и дорогостоящих химиопрепаратов, длительной госпитализации и, тем не менее, часто остается неэффективным, обуславливая высокий удельный вес инвалидизации и смертности.

Основным в решении этой проблемы является своевременная детекция мультирезистентных штаммов на ранних стадиях заболевания, которая позволит контролировать дальнейшее распространение конкретного выявленного штамма и подобрать оптимальную схему химиотерапии. Тем не менее, определение спектра лекарственной резистентности классическими методами на селекционных средах занимает от 3-х недель до 3-х месяцев, что делает полученный результат ретроспективным.

Альтернативным и более перспективным вариантом решения этой проблемы является использование генотипических методов анализа, основанных на выявлении точечных мутаций или других генетических детерминант, обеспечивающих резистентность к антибиотикам. Этот подход стал возможным благодаря определенному успеху в исследовании молекулярных основ резистентности Mycobacterium tuberculosis к таким противотуберкулезным препаратам, как рифампицин [Telenti A.,1993.), изониазид (Sherman DR, 1996.), фторхинолоны (Takiff H. E, et al., 1994), стрептомицин (Heym B., 1994.) и канамицин (Suzuki Y., 1998.). Его отличительной чертой является небольшой срок выполнения анализа, составляющий 2-3 дня.

Рифампицин является одним из основных туберкулостатиков, что обуславливает высокий удельный вес резистентных к нему штаммов. Актуальность выявления резистентности к рифампицину обусловлена тем, что до 80 - 90% рифампицин-резистентных клинических штаммов Mycobacterium tuberculosis устойчивы и к изониазиду, что позволяет считать рифампицин-резистентные штаммы своеобразным косвенным маркером мультирезистентности  (Heym B.et.al., 1994).

Около 95% резистентных к рифампицину штаммов Mycobacterium tuberculosis содержат точечные мутации, делеции или вставки в гене rpoB, кодирующем b - субъединицу РНК-полимеразы. Современные методы генодиагностики резистентности к рифампицину основаны на детекции мутаций, большая часть которых компактно локализована в высоко консервативной области rpoB гена (Telenti A. Et.al., 1993).

Следует отметить, что эффективность такого подхода для детекции резистентных штаммов во многом зависит от того, насколько полно исследованы и охарактеризованы ассоциированные с резистентностью мутации. Считается, что тип и частота встречаемости определенных мутаций в rpoB гене достаточно консервативны среди микобактериальных штаммов, распространенных в различных географических районах. В то же время, в ряде исследований была отмечена и определенная географическая вариабельность таких мутаций  (Rinder H.et.al. , 1997).   К сожалению, штаммы, выявляемые на территории Российской Федерации и стран СНГ, в этом отношении остаются пока малоисследованными.

В целом, с учетом изложенного, прямое секвенирование ПЦР фрагментов rpoB гена выглядит наиболее универсальным генотипическим методом детекции резистентности к рифампицину. Наибольшая информативность такого подхода позволяет максимально полно охарактеризовать весь спектр возможных мутаций и правильно оценить резистентность исследуемых штаммов, а в ряде случаев и их эпидемиологические особенности. Немаловажно, что при большей информативности по сравнению с другими методами себестоимость одного анализа путем прямого секвенирования ниже, чем при использовании набора INNO-LiPA Rif.TB и составляет $3. С технической точки зрения, анализы такого типа можно проводить в специально оборудованных лабораториях противотуберкулезных диспансеров республиканского, краевого и областного подчинения.

Как диагностический прием прямое секвенирование применимо и для выявления резистентности Mycobacterium tuberculosis к другим противотуберкулезным препаратам. Внедрение молекулярно-биологических методов диагностики, основанных на применении полимеразной цепной реакции, значительно повышает эффективность выявления микобактерий туберкулезного комплекса по сравнению с традиционными микробиологическими методами (бактериоскопия, люминесцентная микроскопия, посев). При туберкулезе органов дыхания преимущество ПЦР наиболее ощутимо при недеструктивных и ограниченных формах болезни. При внелегочных формах болезни, характеризующихся олигобациллярностью, более адекватной диагностике будут способствовать использование различных способов выделения ДНК, одновременное исследование различных по характеру биологических образцов от одного больного и применение туберкулино-провокационных проб.

Сочетание молекулярных методов типирования микобактерий туберкулеза с методами прямой детекции (секвенирование) резистентности к химиопрепаратам позволит в дальнейшем проводить не только    статистические мониторинговые эпидемиологические исследования, но и получать достоверные результаты в клинически значимом масштабе времени. (Бочкарёв Е.Г. и др., 2000). (Более подробно см. Skarlatos S.I.,Vellerti P.A., Morris M., Davies P. NEW VISTAS IN THERAPEUTICS: FROM DRUG DESIGN TO GENE THERAPY.
Annals of the New York Academy of Sciences.V.953,dec. 2001.)

Использование гибридизационных технологий открывает новые перспективы генодиагностики вирусных гепатитов В и С. Количественные методики оценки вируса, основанные на детекции продуктов ПЦР реакции путем гибридизации с внутреннем зондом, станут более простыми и общедоступными. Для детекции генетических изменений, встречающихся в популяции вирусов В и С (НВе негативные мутанты ВГВ и генотипы ВГС) возможно использование принципа обратной гибридизации с типоспецифичным зондом. Реализация этих возможностей позволит создать первые отечественные тест-системы для типирования вирусов В и С.(Ильина Е.Н. и др.2000).

Благодаря методу ПЦР, стало возможным выявлять не только ДНК вируса гепатита В, но и определять фрагменты генома вируса, в которых произошла мутация. Так, например, оказалось что НBe – негативный хронический гепатит В (при котором не выявляется HBe Ag) – это мутант вируса гепатита В, у которого мутация произошла в области кодирующей HBeAg (precore мутантный вариант), и инфекция этим вариантом вируса имеет свою клиническую картину. HBe негативный хронический гепатит В имеет больший циррозогенный потенциал и менее эффективно лечится. Открытие мутаций в зоне кодирующей HBsAg, показало, что современная вакцина не сможет предупредить инфекцию этим вариантом вируса (HBV “S” вариант). У небольшого процента больных хроническим гепатитом В вообще не выявляется HBsAg, что, возможно, тоже связано с мутационным процессом, и арбитражным методом диагностики в данном случае является выявление ДНК вируса гепатита В в сыворотке крови. Молекулярно-биологические методы изучения мутационного процесса позволили показать, что возможно как первичное заражение мутантным вариантом вируса гепатита В, так и инфицирование “диким” вариантом с последующей мутацией его в процессе длительной персистенции вируса в организме человека.

С момента внедрения этого метода в клиническую практику прошло не многим более 5 лет, а диагностические возможности этого метода продолжают расширяться и позволяют нам лучше понять патогенез заболевания и разрабатывать новые методы лечения.

РНК-ПЦР пока является единственным высокочувствительным методом диагностики острого гепатита С и обнаружения больных серонегативным хроническим гепатитом С. РНК-ПЦР дает возможность провести генотипирование ВГС и количественную оценку уровня виремии, что позволяет выбрать наиболее благоприятный момент для начала противовирусной терапии и прогнозировать ее исход. С помощью РНК-ПЦР можно обнаружить репликацию ВГС, установить этиологическую и патогенетическую роль ВГС в различных внепеченочных синдромах. Упрощение, стандартизация и, возможно, автоматизация этого метода позволят использовать его при исследовании донорской крови и трансплантируемых органов.

Метод ПЦР используется для постановки и/или подтверждения диагноза, контроля терапии в акушерско-гинекологической практике, неонатологии, педиатрии, урологии, венерологии, нефрологии, гепатологии, пульмонологии, офтальмологии, неврологии, фтизиатрии и др.

Открывается перспектива щирокого применения ПЦР для диагностики цитомегало - и герпес-вирусной инфекции, дифтерии, хеликобактериоза, хламидиоза, бруцеллеза, и других инфекций. При ВИЧ инфекции использование ПЦР диагностики позволяет выявлять инфекцию на ранних её этапах, до сероконверсии, что очень важно  при проверке переливаемой крови. Метод ПЦР перспективен при диагностике гепатита С, проверке крови доноров. Ранняя исчерпывающая полная диагностика создает предпосылки для оперативного проведения противоэпидемических и профилактических мероприятий.

В ближайшие годы основными средствами медицинской диагностики станут автоматизированные системы гибридизационного анализа, использующие биочипы и аффинные сорбенты. Создание соответствующей техники и аналитических процедур необходимого формата интенсивно ведется во всех развитых странах. Создание технологии микрочипов, позволяющей проводить экспресс-анализ разнообразного биологического материала, признано одним из 10 крупнейших научных достижений последних лет.

Впервые биочипы разработаны А.Мирзобековым  ( Институт молекулярной биологии им. Энгельгардта РАН)  в рамках программы сотрудничества с Аргоннской национальной лаборатории США. 19 изобретений, связанных с биологическими микрочипами, полученные в этом совместном российско-американском проекте, лицензированы исключительно фирмами Motorola и Packard Instrument. В июне 1998 года министерство энергетики США объявило, что Аргоннская национальная лаборатория, корпорация Motorola и компания Packard Instrument договорились о разработке и массовом производстве биочипов. Партнеры по предприятию рассчитывают получить наибольший эффект в области медицинской диагностики. По словам представителей компаний, медики - исследователи смогут с помощью биочипов в считанные минуты идентифицировать мутировавшие гены, способные вызвать в будущем проблемы со здоровьем, такие как возникновение раковых опухолей.

Биочипы, по словам представителей компаний, будут первоначально обходиться примерно по 100 дол. за штуку, но со временем их цена опустится до доллара или еще ниже. Выход биочипов на рынок клинической диагностики ожидается через 4-5 лет. (Human Genome news.1998.).В качестве первого объекта для испытания биочипов ученые выбрали иагностику туберкулеза по той причине, что недавно возникшие новые формы туберкулезных бактерий поставили под угрозу все человечество (ежегодно на земном шаре этой болезнью заболевают 8 миллионов человек, из которых 3 миллиона гибнут).

Использование биочипа позволит трансформировать последовательный перебор множества лекарственных препаратов для борьбы с новыми штаммами туберкулеза в параллельный процесс соответствия индивидуального штамма 10 тысячам идентифицированных ДНК туберкулеза. При удачном испытании биочипа начнутся работы по аналогичным оценкам бактерий и вирусов других болезней.(ЕЕ Times, 1999).

В заключение следует отметить, революционизация молекулярно-биологических технологий, которые впоследствии могут найти применение в диагностике и коррекции генетически детерминированных заболеваний, а также в промышленных биотехнологиях, напрямую сопряжена с осуществлением проекта «Геном человека». Уже сейчас растет число частных фирм, которые вкладывают значительные ресурсы в развитие геномных исследований, предполагая получить грандиозные прибыли.

Проект «геном человека» в концентрированной форме отражает формирование новой разновидности науки, которая парадоксальным образом сочетает в себе фундаментальные исследования, производство и коммерческую деятельность.

Проект «Геном человека» создает чрезвычайно важный прецедент для развития науки и ее сотрудничества с общественностью. Впервые реализация крупного международного научного проекта идет одновременно с исследованием социальных последствий и моральных правил его разработки