Генетическая инженерия в растениеводстве - это система экспериментальных приемов, позволяющих конструировать искусственные генетические структуры в виде так называемых рекомбинантных (гибридных) молекул ДНК. Суть генетической инженерии сводится к переносу в растения чужеродных генов, которые могут сообщать растениям полезные свойства (Лутова Л.А.и др., 2000; Глеба Ю.Ю. 1998).
Такие манипуляции осуществляются с помощью соответствующих ферментов - рестрикционных эндонуклеаз, расщепляющих молекулы ДНК в строго определенных участках, и лигаз, сшивающих фрагменты в единую рекомбинантную молекулу ДНК.
Растения имеют одно очень важное преимущество перед животными, а именно возможна их регенерация in vitro из недифференцированных соматических тканей с получением нормальных, фертильных (способных завязывать семена) растений. Это свойство (тотипотентность) открывает для молекулярных биологов большие возможности в изучении функционирования генов, введенных в растения, а также используется в селекции растений. Для конструирования растений необходимо решить следующие задачи: выделить конкретный ген, разработать методы, обеспечивающие включение его в наследственный аппарат растительной клетки, регенерировать из единичных клеток нормальное растение с измененным генотипом. Таким образом, методология генетической инженерии в отношении растений направлена на коренное изменение методов традиционной селекции, с тем чтобы желаемые признаки растений можно было получать путем прямого введения в них соответствующих генов вместо длительной работы по скрещиваниям.
Самый распространенный способ внедрения чужих генов в наследственный аппарат растений - с помощью болезнетворной для растений бактерии Agrobacterium tumefaciens. Эта бактерия умеет встраивать в хромосомы заражаемого растения часть своей ДНК, которая заставляет растение усилить производство гормонов, и в результате некоторые клетки бурно делятся, возникает опухоль. В опухоли бактерия находит для себя отличную питательную среду и размножается. Для генной инженерии специально выведен штамм агробактерии, лишенный способности вызывать опухоли, но сохранивший возможность вносить свою ДНК в растительную клетку.
Нужный ген вклеивают с помощью рестриктаз в кольцевую молекулу ДНК бактерии, так называемую плазмиду. Эта же плазмида несет ген устойчивости к антибиотику. Полученные бактериальные клетки имеют, кроме нового полезного гена, устойчивость к антибиотику.
Вклеивание нужного гена в клетки агробактерии.
Однако поскольку агробактерия не заражает такие важные пищевые растения, как рис, пшеница, кукуруза, разработаны и другие способы. Например, можно ферментами растворить толстую клеточную оболочку растительной клетки, мешающую прямому проникновению чужой ДНК, и поместить такие очищенные клетки в раствор, содержащий ДНК и какое-либо химическое вещество, способствующее ее проникновению в клетку (чаще всего применяется полиэтиленгликоль). Иногда в мембране клеток проделывают микроотверстия короткими импульсами высокого напряжения, а через отверстия в клетку могут пройти отрезки ДНК. Иногда применяют даже впрыскивание ДНК в клетку микрошприцем под контролем микроскопа. Несколько лет назад предложено покрывать ДНК сверхмалые металлические пули , например шарики из вольфрама диаметром 1-2 микрона, и стрелять ими в растительные клетки. Проделываемые в стенке клетки отверстия быстро заживляются, а застрявшие в протоплазме пули так малы, что не мешают клетке функционировать. Часть залпа приносит успех: некоторые пули внедряют свою ДНК в нужное место. Дальше из клеток, воспринявших нужный ген, выращивают целые растения, которые затем размножаются обычным способом.
Наиболее остро стоит вопрос о получении растений, устойчивых к вредителям сельского хозяйства, так как болезни растений стали основным лимитирующим фактором получения урожая. Традиционно используют ген bt, продуктом которого является бактериальный токсин Bacillus thuringiensis. Эта тюрингская бактерия продуцирует крупный белок (протоксин), контролируемый геном bt, который, попадая в кишечник личинок насекомых, разрушается под действием ферментов, а его фрагмент (эндотоксин) приводит к их гибели. В настоящее время уже синтезирован искусственный ген bt, конструкция с которым более эффективна, а сами трансгенные растения обладают широким спектром устойчивости к насекомым. Трансгенные растения картофеля, хлопка, кукурузы с геном bt уже производятся фирмами Monsanto , Ciba Seeds и продаются на рынках мира, хотя дискуссии об их использовании еще не закончены (Глеба Ю.Ю. 1998).
Используется также подход для получения трансгенных растений с antisense RNA (перевернутой или антисмысловой РНК), который позволяет управлять работой интересуемого гена. В этом случае при конструировании вектора копию ДНК (к-ДНК) встраиваемого гена переворачивают на 180 градусов. В результате в трансгенном растении образуется нормальная молекула мРНК и перевернутая, которая в силу комплементарности нормальной мРНК образует с ней комплекс, при этом закодированный белок не синтезируется (Сельскохозяйственная биотехнология,1991.).
Такой подход использован для получения трансгенных растений томатов с улучшенным качеством плодов. Вектор включал к-ДНК гена PG, контролирующего синтез полигалактуроназы (polygalacturonase) - фермента, участвующего в разрушении пектина, основного компонента межклеточного пространства растительных тканей. Продукт гена PG синтезируется в период созревания плодов томатов, а увеличение его количества приводит к тому, что томаты становятся более мягкими, что значительно сокращает срок их хранения. Отключение этого гена в трансгенах позволило получить растения томатов с новыми свойствами плодов, которые не только значительно дольше сохранялись, но и сами растения были более устойчивы к грибным заболеваниям.
Такой же подход можно применить для регулирования сроков созревания томатов, а в качестве мишени в этом случае используют ген EFE (ethylene-forming enzyme), продуктом которого является фермент, участвующий в биосинтезе этилена. [Кулаева О.Н., 1995).
Еще одно направление повышения урожайности растений связано с использованием бактерий, фиксирующих атмосферный азот. Фиксацию азота обеспечивают ферменты - продукты nif-генов. В настоящее время практически решена проблема увеличения дозы nif-генов у клубеньковых бактерий рода Rhizobium. Большинство генов, контролирующих способность этих бактерий к симбиозу с бобовыми растениями, локализуется на плазмидах. Это расширяет возможности использования методов генной инженерии для увеличения эффективности азотфиксации и как следствие - улучшения азотного питания растений. (Проворов Н.А.и др., 1991).
В настоящее время все больший интерес вызывают ассоциативные азотфиксирующие бактерии, не образующие клубеньков и питающиеся корневыми выделениями травянистых растений. Производительность их азотфиксации невелика (30-40 кг азота на 1 га в год), но они имеют широкий круг растений-хозяев. Сейчас найдены ассоциативные симбионты более чем у 110 видов растений, в том числе пищевых и кормовых злаков и овощей. (Дятлова К.Д. Микробные препараты в растениеводстве. Соросовский образовательный журнал.2001, №5).
Следует упомянуть еще об одном направлении в генной инженерии растений, которое до недавнего времени в основном использовали в фундаментальных исследованиях - для изучения роли гормонов в развитии растений. Суть экспериментов заключалась в получении трансгенных растений с комбинацией определенных бактериальных гормональных генов, например только iaaM или ipt и т.д. Эти эксперименты внесли существенный вклад в доказательство роли ауксинов и цитокининов в дифференцировке растений (Лутова Л.А.и др., 1998; Кулаева О.Н., 1995).
В последние годы этот подход стали использовать в практической селекции. Оказалось, что плоды трансгенных растений с геном iaaM, находящимся под промотором гена Def (ген, который экспрессируется только в плодах), являются партенокарпическими, то есть сформировавшимися без опыления. Партенокарпические плоды характеризуются либо полным отсутствием семян, либо очень небольшим их количеством, что позволяет решить проблему лишних косточек , например в арбузе, цитрусовых и т.д. Уже получены трансгенные растения кабачков, которые в целом не отличаются от контрольных, но практически не содержат семян.
Областей применения трансгенных растений множество. На уровне лабораторных экспериментов ведутся работы по получению растений, устойчивых к холоду, тяжелым металлам, повышенному содержанию солей и др. Трансгенные растения, устойчивые к гербицидам (химическим соединениям, которые используют для борьбы с сорняками), к вирусам, растения с повышенным содержанием масел и незаменимых аминокислот уже выращивают на миллионах гектаров.
Не менее интересен и другой аспект работ - получены трансгенные растения с измененными декоративными свойствами. Один из примеров - это получение растений петунии с разноцветными цветками. На очереди голубые розы с геном, контролирующим синтез голубого пигмента, клонированным из дельфиниума. (Лутова Л.А. 2000. №10 ).
Первое трансгенное растение было получено в 1983 г. Биологи встроили в молекулу ДНК картофеля ген Bacillus thuriengiensis, который производит белок, смертельно ядовитый для колорадского жука, в то время как на другие живые организмы он не действует. Точно так же в ДНК кукурузы встраивают ген, защищающий ее от кукурузного мотылька, а в хромосомы хлопка - гены, делающие его несъедобным для насекомых-вредителей.
В настоящее время разработано более 180 видов генетически измененных растений - соя, кукуруза, рис, хлопок, тыква, огурец, перец, дыня и др., включая злаки, которые приобрели устойчивость к насекомым-вредителям, фитопатогенным бактериям, микромицетам и вирусам, к повреждениям при хранении, а также растений, синтезирующих гормоны, привлекающие полезных насекомых.
Сорта, полученные в результате биотехнологии, дают урожай больше, чем обыкновенные культуры. Улучшились и потребительские свойства продуктов. Например, из ГМ-кукурузы, соевых бобов и рапса получается растительное масло, в котором снижено количество насыщенных жиров. Усовершенствованные помидоры, тыква и картофель лучше сохраняют витамины С, Е и бета-каротин. Рис - основной продукт питания во многих развивающихся странах - содержит витамин А и железо, что избавляет от тяжелых болезней, порожденных их дефицитом.
По мнению ученых, широкое использование трансгенной продукции позволит решить проблему обеспечения пищей постоянно увеличивающегося населения планеты. Продукты высокого качества станут доступны всем, поскольку будут стоить недорого. В связи с этим посевы генетических семян в мире постоянно увеличиваются. В 2000 году посевы сои составили 22 млн га, кукурузы - 11,5 млн га, рапса - 4 млн га, хлопка - почти 4 млн га. На первом месте по производству и реализации генных продуктов сейчас стоят США. Прогрессивно развивается эта отрасль в Канаде, Аргентине, Китае, Англии. (Болдырев Ю., 2001г. http://www.soyka.ru/ozd-pit/gmext.shtm).
Одним из наиболее перспективных направлений современной биотехнологии является развитие технологий получения трансгенных животных с заданными хозяйственно ценными признаками, а также создание организмов, обладающих свойствами, не имеющими аналогов в природе. Примером последнего могут служить трансгенные животные с искусственным противовирусным иммунитетом.
В развитых странах мира в настоящее время наблюдается повышенный интерес к технологиям получения трансгенных организмов. Огромные средства вкладываются частными компаниями в создание трансгенных животных и их продвижение в сельскохозяйственную практику. На государственном уровне этот интерес проявляется в виде принятия специальных стратегических программ, направленных на исследования и развитие данной тематики.
Для генетиков растений получение клонов не составляет никаких проблем. В некоторых случаях и у животных получение клона не вызывает удивления и является рутинной процедурой, хотя и не такой уж простой. Генетики получают подобные клоны, когда используемые ими объекты размножаются посредством партеногенеза, то есть бесполым путем, без предшествующего оплодотворения.
Получают клоны и в экспериментальной эмбриологии. Если зародыша морского ежа на стадии раннего дробления искусственно разделить на составляющие его клетки - бластомеры, то из каждого разовьется целый организм. В ходе последующего развития зародышевые клетки теряют эту замечательную способность и становятся все более специализированными. У многих объектов можно также использовать ядра так называемых стволовых эмбриональных клеток от какого-нибудь конкретного раннего эмбриона, которые еще не являются очень специализированными (таковым будет их потомство). Эти ядра пересаживают в яйцеклетки, из которых удалено собственное ядро, и такие яйцеклетки, развиваясь в новые организмы, опять-таки могут образовать клон генетически идентичных животных.
С развитием методов генной инженерии возникли новые перспективы селекции животных. Можно отметить несколько основных направлений исследований в этой области. Создание трансгенных животных с интегрированными генами, продукты, экспрессии которых являются регуляторами обмена веществ животных, изменяют процессы обмена в нужную сторону, обеспечивают высокую продуктивность, экономное расходование кормов и отличное качество продукции. Это и сейчас является главной задачей селекционеров, но с использованием методов генной инженерии процессы селекции могут быть радикально ускорены.
Другое направление селекции - создание популяций животных, генетически устойчивых к ряду инфекционных заболеваний. Следует подчеркнуть, что попытки решить эту задачу традиционными методами селекции заметных успехов не принесли. Однако уже первые попытки создания трансгенных животных с интегрированными генами, связанными с процессами иммунитета, показали, что это направление селекции является перспективным.
Третье направление генно-инженерной селекции - создание животных, являющихся продуцентами биологически активных веществ для медицины и других потребностей человека.
Четвёртым является направление, связанное с получением трансгенных животных - доноров отдельных органов и тканей для человека, здесь огромные перспективы.
Технология получения трансгенных животных, освоенная в самом начале 80-х годах на лабораторных животных, а затем перенесённая на сельскохозяйственных, до настоящего времени ещё не получила выхода в практику. По последним прогнозам зарубежных специалистов, продукция, получаемая от трансгенных животных (безотносительно к их видовому составу), может дойти до массового потребителя через 15-16 лет. Исключение составляет, в связи со способом размножения, трансгенная рыба. Что касается крупного рогатого скота, то прогноз в отношении 15-16-летнего периода, вероятно, слишком оптимистичен.
Названные цели при всей их привлекательности довольно трудно достижимы. Для получения одной трансгенной коровы или быка требуется примерно 1600 микроинъекций генетического материала в ядро зиготы. В порядке сравнения уместно указать, что для овец и коз этот показатель составляет 90-110, а для мышей только 40. По всем названным причинам стоимость получения одной головы трансгенного крупного рогатого скота может превышать 300 тыс. долл. США, расходы на получение трансгенной овцы или козы составляют примерно 60 тыс. долл. Чрезмерно высокая стоимость сводит к ограниченному минимуму возможности получения трансгенного крупного рогатого скота даже в экспериментах.
В последние годы уже выведены трансгенные сельскохозяйственные животные, продукция которых в ближайшей перспективе может приобрести коммерческое значение. Так, в Великобритании получены трансгенные овцы, в молоке которых содержится фактор свёртываемости крови человека, который является радикальным средством лечения гемофилии. Получены козы, выделяющие с молоком лактоферин, который приближает качество молока коз к параметрам женского молока и может быть использован в качестве заменителя женского молока. Выведены трансгенные овцы с интегрированным геном химозина - ключевого фермента сыроделания. Выведены трансгенные свиньи с геном рилизинг-фактора гормона роста. Животные характеризуются рядом интересных положительных признаков, меньшим содержанием жира в туше и большей устойчивостью к заболеваниям. (ЭрнстЛ.,2001. http://sos.priroda.ru/index.php?act=view&g=2&r=336 ).
В настоящее время к категории «трансгенных животных» относят всех животных, полученных в результате генно-инженерных воздействий, в том числе и животных, созданных при помощи эмбриональных стволовых клеток, и животных с выключенными генами. Иногда к трансгенным животным относят и тех, которые были подвергнуты соматической трансфекции, т.е. которым чужеродный ген был введен непосредственно в определенный орган или ткань взрослого организма.
Существуют две основные схемы получения трансгенных животных. Первая из них – микроинъекция чужеродной ДНК в оплодотворенную яйцеклетку – зиготу. Разработанная для получения трансгенных мышей, позднее стала применяться и для получения крупных животных – продуцентов лекарственных белков человека: кроликов, коз, овец, коров. Первый этап такой работы – создание генетической конструкции с заданными свойствами. В настоящее время, когда методы работы с эмбрионами млекопитающих достаточно хорошо разработаны, именно генетическая конструкция является тем критическим фактором, который определяет, будет ли трансгенное животное иметь желаемые свойства. Генная конструкция в составе бактериального вектора клонируется на культуре бактерий Escherichia colli, выделяется и переводится в линеарную форму, которая лучше встраивается в геном эмбриона, чем кольцевая.
На следующем этапе работы работы генетическую конструкцию инъецируют в одноклеточный эмбрион. Затем эмбрионы пересаживают самке-реципиенту, где многие из них нормально имплантируются и развиваются до рождения. Для получения трансгенных животных критическое значение имеет молекулярно-генетический анализ родившегося потомства.
Более новая схема с использованием эмбриональных стволовых клеток получит наибольшее распространение, по-видимому, при создании крупных трансгенных животных. В отличие от метода микроинъекций в зиготу здесь ещё на этапе работы с культурой ЭСК можно проанализировать как встраивание трансгена в геном клетки, так и количество встроившихся копий, а иногда и проверить экспрессию введенного трансгена, что дает возможность выбора линии ЭСК с наилучшими свойствами. ЭСК открыли новые возможности для создания животных как с дополнительными, так и с выключенными генами.
В настоящее время эту технологию используют для получения трансгенных мышей, золотистых хомячков, свиньи, овцы, коровы, кролика, крысы, норки, обезьяны и даже человека. Последняя схема выгодна ещё и тем, что используется не зигота, как для микроинъекций, а бластоцисты, которые легко получаются не хирургическим путем для крупных видов млекопитающих (Семенова М.Л., 2001).
Несмотря на активное развитие биотехнологии в последние десятилетия, основным источником многих необходимых фармакологии лекарственных белковчеловека является донорская кровь. Это факторы свертываемости крови – фибриноген, антитромбины, альбумин, иммуноглобулины и др. без использования которых трудно представить себе современную медицину. Получение таких белков в необходимых количествах и определяет задачу получения трансгенных животных – продуцентов белков человека.
Стратегия этих работ такова: получить трансгенное животное, у которого чужой ген экспрессируется в клетках молочной железы и продукт работы этого гена выделяется в молоко. Трансгенные животные позволяют решить и проблему очистки лекарственных белков. Сейчас активно ведутся работы по получению животных, продуцентов рекомбинантных иммуноглобулинов человека.
В последние 10 лет все чаще привлекаются трансгенные животные модели для установления конкретной причины наследственного заболевания человека. В таблице представлены некоторые широко распространенные заболевания, для которых уже созданы модельные трансгенные линии мышей. (Семенова М.Л., 2001).
При дальнейшем развитии трансгенных технологий возможно появление совершенно новых отраслей их использования. Вероятно уже в недалеком будущем можно ожидать создание мультитрансгенных животных, например, продуцирующих молоко, по своему составу максимально приближенное к материнскому молоку человека. При работе с ЭСК это выглядит вполне выполнимо уже в ближайшие 10-15 лет. Примерно в это же время можно реально ожидать появление трансгенных животных – доноров человеческих органов.
Очевидно, что для трансгенных животных будут найдены и другие области применения – в XXI веке их использование может стать столь же распространенной технологией, как использование микроорганизмов в биотехнологических производствах конца XX века.
По-видимому, наиболее развивающейся ветвью биотехнологии в ближайшее время станет выведение животных - продуцентов биологически активных веществ медицинского назначения ввиду благоприятных прогнозов коммерческого применения таких продуктов
Совершенно очевидно, что генная инженерия в XXI в. станет одним из важнейших факторов генетического совершенствования сельскохозяйственных животных, и удельный вес продуктов, полученных от трансгенных животных, будет постоянно возрастать.
